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    次氯酸钙大肠杆菌杀灭率检测技术规范与方法优化研究

    发布时间: 2025-09-30  点击次数: 42次

    次氯酸钙大肠杆菌杀灭率检测技术规范与方法优化研究

    一、检测原理与标准依据

    (一)杀菌机制

    次氯酸钙溶于水释放次氯酸(HClO),通过以下途径杀灭大肠杆菌(Escherichia coli 8099):

    1.细胞膜破坏:HClO穿透细胞壁,氧化磷脂双分子层;

    2.蛋白质变性:与酶活性中心巯基(-SH)反应,抑制代谢酶活性;

    3.DNA损伤:破坏核酸结构,阻止细胞复制1。

    (二)标准方法

    国标:GB/T 27952-2020《消毒剂卫生要求》悬液定量杀灭试验;

    国际标准:EN 1276《化学消毒剂和防腐剂 食品、工业、家庭和公共区域用化学消毒剂杀菌活性评价》2。

    二、试验材料与试剂配制

    (一)菌株与培养基

    1.标准菌株:大肠杆菌8099(CMCC(B) 44102),由中国普通微生物菌种保藏中心提供;

    2.培养基:营养琼脂(NA),pH 7.0±0.2,121℃灭菌20分钟1。

    (二)关键试剂

    次氯酸钙溶液:

    母液:称取0.5 g次氯酸钙(有效氯65%),用无菌水溶解定容至100 mL,有效氯浓度3250 mg/L;

    工作液:用PBS稀释至500 mg/L(按杀灭要求调整)3。

    中和剂:

    0.1%硫代liu酸钠(Na₂S₂O₃)溶液,中和有效氯至<0.1 mg/L1。

    三、试验流程与操作规范

    (一)菌悬液制备

    活化培养:

    将冻干菌种接种至NA斜面,37℃培养18-24小时;

    挑取单菌落转接至营养肉汤,37℃振荡培养6小时(对数生长期)。

    稀释与干扰物添加:

    用0.03 mol/L PBS(含10%小牛血清)稀释菌液至1×10⁸ CFU/mL;

    混匀后备用,2小时内使用2。

    (二)杀灭试验步骤

    样品处理:

    取5 mL次氯酸钙工作液(500 mg/L)至灭菌试管,37℃水浴预热5分钟;

    加入5 mL菌悬液(1×10⁸ CFU/mL),立即计时并混匀。

    作用与终止:

    20℃±1℃避光作用10分钟(按产品说明书调整作用时间);

    取1.0 mL混合液至9.0 mL中和剂,混匀后静置10分钟1。

    培养与计数:

    取中和后液体1.0 mL,用PBS梯度稀释(10⁻¹-10⁻³);

    各稀释度取0.5 mL倾注NA平板,37℃培养48小时,计数菌落数(CFU)2。

    (三)对照组设置

    对照组类型操作步骤作用

    阳性对照组菌悬液+PBS(不加消毒剂)验证菌活性

    阴性对照组中和剂+培养基验证无菌操作

    中和剂对照组消毒剂+中和剂+菌悬液验证中和剂有效性

    四、结果计算与判定标准

    (一)杀灭率计算

    杀灭率()

    符号说明:

    试验组活菌数(CFU/mL);

    阳性对照组活菌数(CFU/mL)1。

    (二)判定标准

    产品类型作用时间(min)有效氯浓度(mg/L)杀 灭率要求(%)

    饮用水消毒剂                             10                          500≥99.9

    物体表面消毒剂                     5                                 800≥99.99

    五、影响因素与优化策略

    (一)关键因素控制

    因素                            优化条件                                         效果

    有效氯浓度  500-1000 mg/L(根据有机物调整)  杀灭率提升至99.99%

    作用pH               6.5-7.5(中性条件)                  HClO占比达80%以上

    温度20-25℃         温度每升高10℃,                           杀灭时间缩短一半

    (二)常见问题解决方案

    问题现象                                 原因分析                                  解决措施

    杀灭率偏低有 效氯浓度不足或中和剂过量重新标定浓度,调整中和剂用量至9 mL

    菌落蔓延                            菌悬液浓度过高                         增加稀释梯度至10⁻⁴

    中和剂失效                  硫代liu酸钠氧化                          使用新鲜配制的中和剂

    六、质量控制与应用场景

    (一)质控指标

    1.菌悬液浓度:1×10⁸±0.5×10⁸ CFU/mL;

    2.中和剂有效性:中和后残留菌数≤10 CFU/mL2。

    (二)典型应用

    1.饮用水消毒:验证次氯酸钙投加后大肠杆菌达标(≤0 CFU/100 mL);

    2.医疗环境表面:物体表面擦拭后杀灭率≥99.99%1。

    关键词:次氯酸钙;大肠杆菌;杀灭率;悬液定量试验;GB/T 27952

    参考文献

    [1] GB/T 27952-2020 消毒剂卫生要求[S].

    [2] EN 1276 化学消毒剂杀菌活性评价[S].

    [3] WHO 饮用水消毒指南[S].

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