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次氯酸钙大肠杆菌杀灭率检测技术规范与方法优化研究
发布时间: 2025-09-30 点击次数: 42次次氯酸钙大肠杆菌杀灭率检测技术规范与方法优化研究
一、检测原理与标准依据
(一)杀菌机制
次氯酸钙溶于水释放次氯酸(HClO),通过以下途径杀灭大肠杆菌(Escherichia coli 8099):
1.细胞膜破坏:HClO穿透细胞壁,氧化磷脂双分子层;
2.蛋白质变性:与酶活性中心巯基(-SH)反应,抑制代谢酶活性;
3.DNA损伤:破坏核酸结构,阻止细胞复制1。
(二)标准方法
国标:GB/T 27952-2020《消毒剂卫生要求》悬液定量杀灭试验;
国际标准:EN 1276《化学消毒剂和防腐剂 食品、工业、家庭和公共区域用化学消毒剂杀菌活性评价》2。
二、试验材料与试剂配制
(一)菌株与培养基
1.标准菌株:大肠杆菌8099(CMCC(B) 44102),由中国普通微生物菌种保藏中心提供;
2.培养基:营养琼脂(NA),pH 7.0±0.2,121℃灭菌20分钟1。
(二)关键试剂
次氯酸钙溶液:
母液:称取0.5 g次氯酸钙(有效氯65%),用无菌水溶解定容至100 mL,有效氯浓度3250 mg/L;
工作液:用PBS稀释至500 mg/L(按杀灭要求调整)3。
中和剂:
0.1%硫代liu酸钠(Na₂S₂O₃)溶液,中和有效氯至<0.1 mg/L1。
三、试验流程与操作规范
(一)菌悬液制备
活化培养:
将冻干菌种接种至NA斜面,37℃培养18-24小时;
挑取单菌落转接至营养肉汤,37℃振荡培养6小时(对数生长期)。
稀释与干扰物添加:
用0.03 mol/L PBS(含10%小牛血清)稀释菌液至1×10⁸ CFU/mL;
混匀后备用,2小时内使用2。
(二)杀灭试验步骤
样品处理:
取5 mL次氯酸钙工作液(500 mg/L)至灭菌试管,37℃水浴预热5分钟;
加入5 mL菌悬液(1×10⁸ CFU/mL),立即计时并混匀。
作用与终止:
20℃±1℃避光作用10分钟(按产品说明书调整作用时间);
取1.0 mL混合液至9.0 mL中和剂,混匀后静置10分钟1。
培养与计数:
取中和后液体1.0 mL,用PBS梯度稀释(10⁻¹-10⁻³);
各稀释度取0.5 mL倾注NA平板,37℃培养48小时,计数菌落数(CFU)2。
(三)对照组设置
对照组类型操作步骤作用
阳性对照组菌悬液+PBS(不加消毒剂)验证菌活性
阴性对照组中和剂+培养基验证无菌操作
中和剂对照组消毒剂+中和剂+菌悬液验证中和剂有效性
四、结果计算与判定标准
(一)杀灭率计算
杀灭率()
符号说明:
试验组活菌数(CFU/mL);
阳性对照组活菌数(CFU/mL)1。
(二)判定标准
产品类型作用时间(min)有效氯浓度(mg/L)杀 灭率要求(%)
饮用水消毒剂 10 500≥99.9
物体表面消毒剂 5 800≥99.99
五、影响因素与优化策略
(一)关键因素控制
因素 优化条件 效果
有效氯浓度 500-1000 mg/L(根据有机物调整) 杀灭率提升至99.99%
作用pH 6.5-7.5(中性条件) HClO占比达80%以上
温度20-25℃ 温度每升高10℃, 杀灭时间缩短一半
(二)常见问题解决方案
问题现象 原因分析 解决措施
杀灭率偏低有 效氯浓度不足或中和剂过量重新标定浓度,调整中和剂用量至9 mL
菌落蔓延 菌悬液浓度过高 增加稀释梯度至10⁻⁴
中和剂失效 硫代liu酸钠氧化 使用新鲜配制的中和剂
六、质量控制与应用场景
(一)质控指标
1.菌悬液浓度:1×10⁸±0.5×10⁸ CFU/mL;
2.中和剂有效性:中和后残留菌数≤10 CFU/mL2。
(二)典型应用
1.饮用水消毒:验证次氯酸钙投加后大肠杆菌达标(≤0 CFU/100 mL);
2.医疗环境表面:物体表面擦拭后杀灭率≥99.99%1。
关键词:次氯酸钙;大肠杆菌;杀灭率;悬液定量试验;GB/T 27952
参考文献
[1] GB/T 27952-2020 消毒剂卫生要求[S].
[2] EN 1276 化学消毒剂杀菌活性评价[S].
[3] WHO 饮用水消毒指南[S].
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