次氯酸钙金黄色pu萄球菌灭活效果检测技术规范与方法优化研究

次氯酸钙金黄色pu萄球菌灭活效果检测技术规范与方法优化研究  

一、检测原理与标准依据  

（一）杀菌机制  

次氯酸钙溶于水释放次氯酸（HClO），通过以下途径杀灭金黄色pu萄球菌（StaphylococcusaureusATCC6538）：  

1.细胞膜破坏：HClO穿透细胞壁，氧化磷脂双分子层；  

2.蛋白质变性：与酶活性中心巯基（-SH）反应，抑制代谢酶活性；  

3.DNA损伤：破坏核酸结构，阻止细胞复制1。  

（二）标准方法  

国标：GB/T27954-2020《消毒剂卫生要求》悬液定量杀灭试验；  

国际标准：EN13704《化学消毒剂和防腐剂食品、工业、家庭和公共区域用化学消毒剂杀菌活性评价》2。  

二、试验材料与试剂配制  

（一）菌株与培养基  

1.标准菌株：金黄色pu萄球菌ATCC6538，由中国普通微生物菌种保藏中心提供；  

2.培养基：营养琼脂（NA），pH7.0±0.2，121℃灭菌20分钟1。  

（二）关键试剂  

1. 次氯酸钙溶液：  

母液：称取0.5g次氯酸钙（有效氯65%），用无菌水溶解定容至100mL，有效氯浓度3250mg/L；  

工作液：用PBS稀释至500mg/L（按杀灭要求调整）3。    

中和剂：  

0.1%硫代liu酸钠（Na₂S₂O₃）溶液，中和有效氯至＜0.1mg/L1。  

三、试验流程与操作规范  

（一）菌悬液制备  

1.活化培养：  

将冻干菌种接种至NA斜面，37℃培养18-24小时；  

挑取单菌落转接至营养肉汤，37℃振荡培养6小时（对数生长期）。   

稀释与干扰物添加：  

用0.03mol/LPBS（含10%小牛血清）稀释菌液至1×10⁸CFU/mL；  

混匀后备用，2小时内使用2。  

（二）杀灭试验步骤  

样品处理：  

取5mL次氯酸钙工作液（500mg/L）至灭菌试管，37℃水浴预热5分钟；  

加入5mL菌悬液（1×10⁸CFU/mL），立即计时并混匀。    

作用与终止：  

20℃±1℃避光作用10分钟（按产品说明书调整作用时间）；  

取1.0mL混合液至9.0mL中和剂，混匀后静置10分钟1。   

培养与计数：    

取中和后液体1.0mL，用PBS梯度稀释（10⁻¹-10⁻³）；  

各稀释度取0.5mL倾注NA平板，37℃培养48小时，计数菌落数（CFU）2。  

（三）对照组设置  

对照组类型操作步骤作用  

阳性对照组菌悬液+PBS（不加消毒剂）验证菌活性  

阴性对照组中和剂+培养基验证无菌操作  

中和剂对照组消毒剂+中和剂+菌悬液验证中和剂有效性  

四、结果计算与判定标准  

（一）杀灭率计算  

杀灭率（）  

符号说明：  

试验组活菌数（CFU/mL）；  

阳性对照组活菌数（CFU/mL）1。  

（二）判定标准  

产品类型作用时间（min）有效氯浓度（mg/L）杀灭率要求（%）  

物体表面消毒剂10500≥99.99  

手消毒剂1.51000≥99.999  

五、影响因素与优化策略  

（一）关键因素控制  

因素优化条件效果  

有效氯浓度500-1000mg/L（根据有机物调整）杀灭率提升至99.99%  

作用pH6.5-7.5（中性条件）HClO占比达80%以上  

温度20-25℃温度每升高10℃，杀灭时间缩短一半  

（二）常见问题解决方案  

问题现象原因分析解决措施  

杀灭率偏低有效氯浓度不足或中和剂过量重新标定浓度，调整中和剂用量至9mL  

菌落蔓延菌悬液浓度过高增加稀释梯度至10⁻⁴  

中和剂失效硫代liu酸钠氧化使用新鲜配制的中和剂  

六、质量控制与应用场景  

（一）质控指标  

1.菌悬液浓度：1×10⁸±0.5×10⁸CFU/mL；  

2.中和剂有效性：中和后残留菌数≤10CFU/mL2。  

（二）典型应用  

1.医疗环境表面：物体表面擦拭后杀灭率≥99.99%；  

2.食品加工设备：消毒后金黄色pu萄球菌残留≤10CFU/cm²1。  

关键词：次氯酸钙；金黄色pu萄球菌；杀灭率；悬液定量试验；GB/T27954  

参考文献  

[1]GB/T27954-2020消毒剂卫生要求[S].  

[2]EN13704化学消毒剂杀菌活性评价[S].  

[3]WHO饮用水消毒指南[S].